Натрийуретические пептиды

Исторический аспект

Кардиомиоциты предсердий млекопитающих содержат сильно развитые комплекс Гольджи и шероховатый эндоплазматический ретикулум, а также многочисленные гранулы, что позволило предположить, что клетки предсердий могут выполнять секреторную функцию. В 1981 году deBold и соавторы показали, что инъекция крысам экстракта предсердий приводит к быстрому и выраженному увеличению выведения натрия и мочи. Несколькими годами позже из предсердий крыс был выделен пептидный гормон — предсердный натрийуретический пептид (Atrial Natriuretic Peptide, ANP), обладающий натрийуретическим и диуретическим действием. Вскоре были обнаружены два других пептидных гормона, обладающих сходным строением с ANP. Все три пептида принято объединять в семейство натрийуретических пептидов.

В 1988 году из мозга свиньи был выделен пептид, получивший название мозговой натрийуретический пептид (Brain Natriuretic Peptide, BNP). Позднее было показано, что BNP экспрессируется преимущественно в кардиомиоцитах, поэтому в последнее время чаще используется название «натрийуретический пептид B-типа» (B-type Natriuretic Peptide).

В 1990 году из мозга свиньи был выделен третий представитель семейства — натрийуретический пептид С-типа (C-type Natriuretic Peptide, CNP).

Строение натрийуретических пептидов

Аминокислотная последовательность натрийуретических пептидов высокогомологична. Натрийуретические пептиды содержат центральное кольцо, состоящее из 17 аминокислотных остатков (а.к.о.), замкнутое дисульфидной связью между двумя остатками цистеина, и боковые цепи различной длины. BNP человека состоит из 32 а.к.о., ANP — из 28 а.к.о. Для CNP известны две формы, состоящие из 22 и 53 а.к.о., отличающиеся длиной N-концевого участка. Аминокислотные последовательности внутри кольца высокогомологичны — 11 из 17 а.к.о идентичны для всех трех пептидов (Рис. 1).

BNP structure.png

Рис. 1. Аминокислотная последовательность натрийуретических пептидов ANP, BNP и CNP человека. Темным цветом выделены аминокислотные остатки, общие для всех трех пептидов.

Синтез и секреция BNP

Основным местом синтеза BNP являются кардиомиоциты. Экспрессия мРНК BNP была обнаружена как в предсердиях, так и в желудочках сердца. Однако считается, что левый желудочек является основным источником BNP в организме. Секреция BNP в кровоток происходит по мере синтеза, лишь небольшое количество синтезированного BNP запасается в предсердных секреторных гранулах. Это принципиально отличает BNP от ANP, для которого показано, что основная часть синтезированного пептида запасается в виде молекул-предшественников в секреторных гранулах.

Уровень экспрессии гена BNP и секреция BNP в кровоток значительно увеличиваются в ответ на повышение давления на стенки камер сердца. Увеличение уровня экспрессии гена BNP наблюдается при различных сердечных заболеваниях, а также при заболеваниях легких и нарушениях функции почек. Однако наиболее высокие концентрации BNP в крови обнаруживаются у больных с сердечной недостаточностью.

BNP синтезируется кардиомиоцитами в виде прогормона proBNP, состоящего из 108 а.к.о. (11905 Да). Образование активного гормона происходит в результате расщепления proBNP специфичной конвертазой между 76 и 77 а.к.о (Рис. 2). Расщепление proBNP приводит к образованию С-концевого фрагмента BNP (32 а.к.о., 3466 Да), и N-концевого фрагмента (N-terminal proBNP, NT-proBNP), состоящего из 76 а.к.о. (8457 Да). Считается, что расщепление proBNP происходит либо внутриклеточно, либо на поверхности кардиомиоцита при секреции в кровоток. Фермент, который отвечает за расщепление proBNP, достоверно не установлен. Предполагается, что одна из двух конвертаз (фурин или корин) участвует в процессинге proBNP. Оба фрагмента BNP и NT-proBNP выделяются в кровь в эквимолярном соотношении (поэтому концентрация NT-proBNP в крови также увеличивается при повышении уровня экспрессии гена BNP). Считается, что NT-proBNP не активен и не обладает биологической функцией.

Схема строения BNP.png

Рис. 2. Схема образования BNP человека.

Достоверно показано, что часть молекул proBNP не расщепляются в кардиомиоцитах и секретируются в кровь вместе с BNP и proBNP. Причем, концентрация proBNP в крови в несколько раз превышает концентрацию активного гормона BNP. Механизмы, которые могут приводить к появлению нерасщепленного proBNP в крови, причины высокого соотношения концентраций proBNP/BNP в крови, а также значение неполного процессинга proBNP для организма активно изучаются.

Физиологическое действие BNP

BNP является антагонистом симпатической нервной системы и ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, активность которых повышается при сердечной недостаточности. Ниже представлены основные физиологические эффекты натрийуретических пептидов:

  • ингибирование реабсорбции натрия в проксимальном и дистальном канальцах

  • увеличение проницаемости эндотелия

  • повышение натрийуреза и диуреза

  • расслабление стенок и расширение кровеносных сосудов, понижение артериального давления

  • повышение скорости клубочковой фильтрации в почках

  • ингибирование гипертрофии кардиомиоцитов и фиброза сердца

Факторы, влияющие на уровень BNP и NT-proBNP в крови

В настоящее время BNP и NT-proBNP широко используются в клинической практике в качестве биохимических маркеров сердечной недостаточности.

У здоровых людей концентрация BNP в крови составляет 10-70 пг/мл, NT-proBNP– 20-300 пг/мл. При сердечной недостаточности концентрация BNP может увеличиваться до 5 нг/мл, NT-proBNP – до 100 нг/мл. Более высокие концентрации NT-proBNP в крови по сравнению с BNP связаны с большим временем жизни NT‑proBNP в кровотоке.

Однако уровень BNP и NT-proBNP в крови повышается не только при сердечной недостаточности, но и при других патологиях, что необходимо учитывать при постановке диагноза (Таблица 1).

Уровень BNP и NT-proBNP в крови зависит от пола (выше у женщин, чем у мужчин) и возраста. Уровень обоих маркеров в крови  повышается с увеличением возраста пациента. В связи с этим было предложено использовать различные пороговые значения в зависимости от пола и (или) возраста больного. Так, компания Roche рекомендует использовать различные пороговые значения концентрации NT-proBNP для пациентов в возрасте до 75 лет (125 пг/мл) и старше 75 лет (450 пг/мл). В то же время в методах для определения BNP рекомендуется использовать единый пороговый уровень 100 пг/мл для всех пациентов.

Болезни, сопровождающиеся увеличением концентрации натрийуретических пептидов в крови

Также на концентрацию BNP и NT-proBNP в крови влияют уровень гемоглобина и масса тела. Концентрация обоих пептидов в крови повышается при анемии. У пациентов с высоким индексом массы тела (больше 25 кг/м2) концентрация BNP и NT-proBNP значительно ниже, чем у пациентов с нормальной массой тела.

Методы для определения BNP и NT-proBNP в крови

Современные методы количественного определения BNP и NT-proBNP в крови разработаны на основе метода сэндвич-иммуноанализа. Метод позволяет добиться высокой чувствительности, что крайне важно, учитывая низкий уровень BNP и NT-proBNP в крови здоровых людей. Чувствительность существующих методов для определения BNP составляет 1-10 пг/мл, NT-proBNP – 5-15 пг/мл.

В методах для определения BNP используется пара моноклональных антител, либо комбинация моно- и поликлональных антител (Таблица 2). Например, одно из используемых антител специфично к кольцевой структуре, а другое к C-концевому либо N-концевому участку пептида. Поскольку для натрийуретических пептидов характерна высокая степень гомологии, для создания диагностических систем отбираются антитела, не обладающие перекрестным взаимодействием с ANP и CNP. Использование антител разной эпитопной специфичности, а также различия в калибраторах приводят к тому, что результаты измерения BNP в одном и том же образце, полученные с использованием разных методов, могут отличаться.

Системы для определения концентрации BNP в крови

*Обе системы Triage и Beckman используют те же самые антитела, но не являются одинаковыми, т.к. имеют отличия в подходах использования моноклональных и поликлональных антител в качестве антител подложки и детекторных антител.

Диагностические системы первого поколения для определения концентрации NT-proBNP были созданы на основе поликлональных антител, специфичных к участкам 1-21 и 39-50. В 2008 году был разработан метод второго поколения (RocheDiagnosticsproBNPII) на основе моноклональных антител, специфичных к участкам 27-31 и 42-46. В настоящее время в лабораторной диагностике используются системы как первого, так и второго поколений (Таблица 3).

Системы для определения концентрации NT-proBNP в крови

Факторы, влияющие на определение концентрации BNP и NT-proBNP

Протеолитическая деградация.BNP не стабилен и после секреции в кровь подвергается деградации под действием эндогенных протеаз. Наиболее подвержен деградации N-конец молекулы BNP. Суммарное содержание различных фрагментов BNP в крови в несколько раз превышает количество интактного BNP 1-32. Протеолитическая деградация BNP негативно влияет на «узнавание» антигена антителами, используемыми в диагностических системах, что может приводить к занижению концентрации пептида в образце.

Перекрестное взаимодействие с proBNP. Существующие методы для количественного определения BNP также способны детектировать proBNP, концентрация которого в несколько раз превышает концентрацию BNP в крови. Поэтому концентрация BNP, измеренная в образце крови с использованием таких систем, отражает суммарное содержание обеих форм – proBNP и BNP. При этом proBNP вносит основной вклад в общий сигнал. Системы для определения NT‑proBNP также способны детектировать proBNP. Однако, принимая во внимание существенное преобладание в крови NT-proBNP над proBNP, можно заключить, что вклад proBNP в измерение концентрации NT-proBNP незначителен.

Гликозилирование молекул NT-proBNP. Центральная часть молекулы NT-proBNP гликозилирована. Гликозилирование негативно влияет на измерение концентрации NT-proBNP в крови, поскольку углеводные остатки препятствуют взаимодействию антител с NT-proBNP. Эпитопы используемых в диагностических системах антител расположены вблизи сайтов гликозилирования молекулы NT-proBNP (участки 39-50 и 42-46). Это приводит к тому, что концентрация NT-proBNP в образцах серьезно (иногда в несколько раз) недооценивается. Уровень гликозилирования NT-proBNP отличается у пациентов, поэтому погрешность метода не постоянна. Клиническое значение этого не установлено, ведутся исследования.

Стабильность BNP и NT-proBNP в образцах

Для определения уровня BNP используется только EDTA-плазма, либо цельная кровь, собранная в пробирки, содержащие EDTA (TriageBNP). Концентрация BNP, определенная в образцах сыворотки, гепариновой и цитратной плазмы оказывается значительно ниже концентрации, определенной в EDTA-плазме.

Invitro стабильность BNP отличается для разных методов (зависит от эпитопов антител). Плазму, предназначенную для измерения концентрации BNP, рекомендуется хранить при 0-4°С и проводить измерения концентрации как можно быстрее. В целом, BNP стабилен в течение 4 часов хранения при комнатной температуре и 8 часов при температуре 4°C в пробах цельной крови, содержащей EDTA.

Для измерения концентрации NT-proBNP могут быть использованы сыворотка, гепариновая и EDTA-плазма. NT-proBNP стабилен в сыворотке в течение 72 часов инкубации при комнатной температуре.

BNP и NT-proBNP как биохимические маркеры сердечной недостаточности

Сложность диагностики сердечной недостаточности состоит в неспецифичности симптомов (одышка, быстрая утомляемость, отеки), которые могут быть вызваны другими заболеваниями, либо возникать из-за ожирения или плохой физической формы пациентов. Многочисленные исследования подтвердили эффективность использования BNP и NT-proBNP при обследовании пациентов с острой и хронической сердечной недостаточностью. Однако необходимо иметь ввиду, что для обоих маркеров характерна высокая чувствительность, но относительно низкая специфичность при определении сердечной недостаточности. Низкая специфичность связана с тем, что уровень обоих маркеров может повышаться при других заболеваниях. Поэтому измерение концентрации BNP (NT-proBNP) целесообразно использовать в качестве первичного диагностического теста. Если концентрация BNP (NT-proBNP) в крови ниже порогового уровня, то сердечная недостаточность может быть исключена с высокой вероятностью ~98%. В том случае, если концентрация BNP (NT-proBNP) повышена, то требуется проведение эхокардиографии для того чтобы подтвердить наличие дисфункции левого желудочка. Таким образом, измерение концентрации BNP (NT-proBNP) позволяет уменьшить группу пациентов, которым требуется проведение эхокардиографии. В случае острой сердечной недостаточности, измерение концентрации BNP (NT-proBNP) позволяет быстрее установить правильный диагноз и начать терапию. Таким образом, BNP (NT-proBNP) используются не для установления диагноза сердечной недостаточности, а для ее исключения у пациентов с выраженными симптомами. В настоящее время измерение концентрации BNP (NT-proBNP) наряду с клиническим обследованием, эхокардиографией, электрокардиографией и рентгенографией грудной клетки рекомендовано Европейским обществом кардиологов для использования при диагностике сердечной недостаточности и дисфункции левого желудочка сердца.

Скачать описание продукта в формате pdf

Моноклональные антитела к BNP

Рекомбинантный proBNP человека


← Назад к списку статей


Техподдержка