Аффинная хроматография

Аффинная хроматография — это разновидность адсорбционной хроматографии. Основной особенностью аффинной хроматографии является наличие комплементарности между иммобилизованным на матрице лигандом и вторым партнером пары взаимодействующих компонентов, который извлекается из смеси с другими, не комплементарными лиганду веществами. Использование высокоизбирательного взаимодействия позволяет за одну стадию достичь очень высокой степени очистки искомого вещества. Аффинное взаимодействие является нековалентным и может быть ослаблено путем изменения рН, ионной силы раствора, введения в раствор веществ, препятствующих образованию комплементарных связей. Важными преимуществами аффинной хроматографии являются: высокая избирательность, эффект концентрирования искомого вещества на аффинной матрице и освобождение от гидролитических ферментов. Аффинная очистка часто позволяет сохранить нативную структуру вещества.Чаще всего лиганд иммобилизуют на матрице ковалентно. Для закрепления лиганда матрица должна быть предварительно активирована, то есть на поверхности частиц носителя должны быть созданы реакционноспособные группы. Наиболее распространенный способ активации — создание на поверхности матрицы электрофильных групп, способных к взаимодействию с нуклеофильными группами лиганда. При этом процесс иммобилизации лиганда сводится к его инкубации с активированной матрицей. Следует отметить, что скорость протекания реакции сильно зависит от pH среды. В иммунохимии применяют как иммобилизацию антигена на матрице, так и присоединение к матрице антител. Разновидность аффинной хроматографии, в которой в качестве иммобилизованного лиганда используются антитела, носит название иммуноаффинной хроматографии.

Одним из наиболее распространенных носителей, используемых в биохимии уже на протяжении нескольких десятилетий, является сефароза — специальным образом обработанные сферические гранулы агарозы. Известно несколько способов активации сефарозы, однако чаще других применяют метод активации сефарозы с использованием бромциана (BrCN). Преимуществом данного метода является простота, высокая устойчивость образующихся связей, стабильность сефарозы в довольно широком диапазоне рН (от 2,0 до 12,0). Относительная жесткость и крупные размеры частиц сефарозы позволяют использовать такие носители в колоночной хроматографии при достаточно высоких скоростях подачи растворов на колонку.

Активацию сефарозы осуществляют в процессе инкубации раствора бромциана с водной суспензией сефарозы. Бромциан взаимодействует с гидроксильными группами сефарозы, в результате чего образуется имидокарбонат, содержащий электрофильный атом углерода. Помимо этого в ходе реакции образуется неактивный карбамат, не способный к реакции с нуклеофильными боковыми группами аминокислот. При взаимодействии имидокарбоната с нуклеофильными группами, прежде всего с e-аминогруппами лизина, происходит образование прочной ковалентной связи белка с активированной матрицей через остаток изомочевины или N-замещенного карбамата (рис. 1). Реакция активации матрицы бромцианом проходит только в щелочной среде с выделением бромистоводородной кислоты, для нейтрализации которой требуется постоянное добавление щелочи к реакционной смеси. Реакция бромциана с гидроксилами матрицы экзотермична, поэтому ее проводят на ледяной бане.

Схема иммобилизации белка

Рис. 1. Схема иммобилизации белка на BrCN-активированной сефарозе

Нужно заметить, что активными нуклеофилами, кроме e-аминогрупп лизина, являются также SH-группа цистеина, концевые аминогруппы белков и ОН-группа тирозина (по активности данные группы располагаются в следующем порядке: SH- ˃ концевая NH2- ˃ OH-группа тирозина). С другой стороны, тиоэфиры менее прочны, чем кислородные эфиры, а последние уступают по прочности амидным связям.

В иммунохимических исследованиях с использованием BrCN-активированной сефарозы готовят два типа носителей — носители с иммобилизованными антигенами и носители с иммобилизованными антителами. Первые имеют ограниченное применение и используются, как правило, для выделения из сыворотки иммунного животного (содержащей антитела различной специфичности) пула антител, специфичных только к белку, иммобилизованному на носителе. Гораздо чаще на практике используют носители с иммобилизованными антителами. Основная область применения таких носителей — экстракция из грубой смеси макромолекул (как правило — белков). Высокая специфичность антител к антигену позволяет за короткий промежуток времени и в одну стадию получить высокоочищенный (с чистотой до 95-99%) препарат белка.

Установка для колоночной иммуноаффинной хроматографии

Рис. 2. Установка для колоночной иммуноаффинной хроматографии

Экстракцию исследуемого белка из смеси осуществляют двумя способами. Первый, используемый, как правило, для получения препаративных количеств белка, основан на применении метода колоночной иммуноаффинной хроматографии (Рис.2). В зависимости от поставленной задачи аффинным носителем заполняют колонки различного диаметра (от нескольких миллиметров до метра) и через эти колонки пропускают белковый раствор, содержащий исследуемый антиген. Большинство макромолекул проходит через частицы носителя не задерживаясь, в то время как между антителами, иммобилизованными на носителе, и антигеном, содержащимся в растворе, образуется иммунный комплекс (рис. 3). После отмывки носителя от не связавшихся белков иммунный комплекс разрушают, пропуская через носитель растворы с низкими (pH 2,0 — pH 4,0) или высокими (pH 11,0 — pH 12,0) значениями рН, либо растворы с высокой ионной силой (2М NaCl), либо растворы, содержащие хаотропные соединения (KSCN). При этом исследуемый белок элюируют с носителя, его собирают и переводят в оптимальный для хранения данного белка буфер.

Схема хроматографии белков на аффинном носителе

Рис. 3. Схема хроматографии белков на аффинном носителе.

Второй способ экстракции исследуемого белка из сложной смеси — иммунопреципитация, или экстракция в объеме. Иммунопреципитацию используют при работе с незначительными (нано- и микрограммы) количествами вещества. При этом объем аффинного носителя обычно не превышает сотен микролитров, а объем исследуемого образца — нескольких миллилитров. То есть, иммунопреципитацию используют в тех ситуациях, когда из-за малого количества исследуемого вещества оказывается технически сложным создать адекватную по размерам аффинную колонку.

Схема аффинного выделения белков методом иммунопреципитации

Рис. 4. Схема аффинного выделения белков методом иммунопреципитации.

При проведении иммунопреципитации образец, содержащий исследуемый белок, некоторое время инкубируют (при постоянном перемешивании) с частицами носителя. В процессе инкубации образуется иммунный комплекс, и исследуемый белок переходит из раствора на частицы носителя. После этого носитель осаждают, как правило, центрифугированием, супернатант отбрасывают, а иммунный комплекс, иммобилизованный на частицах носителя, разрушают добавлением тех же растворов, что и в случае с колоночной хроматографией (рис. 4). Также иммунный комплекс может быть разрушен ДСН-содержащим буфером, который используют для приготовления образца белка при проведении ДСН электрофореза. Такой буфер используют в том случае, если в дальнейшем планируют изучать экстрагированный белок с использованием метода электрофореза в денатурирующих условиях, или методом вестерн-блоттинг. Однако при использовании данного метода элюции белка следует учитывать, что повторное использование носителя становится невозможным из-за денатурации иммобилизованных антител. Кроме того, исследуемый образец помимо целевого белка будет содержать легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов.

Версия для печати



← Назад к списку статей


Техподдержка